基因敲除突變體制作(KO))


基因敲除技術是人為地使靶基因的序列發生堿基對的增添、缺失或替換,引起的靶基因結構的改變,以達到定點修飾改造特定基因的目的?;蚯貿際跏欠聰蛞糯а芯恐兇鈧匾募際豕ぞ??;蚯貿唄磧愎惴河τ糜諞糯?、發育生物學、細胞生物學、醫學、環境毒理學、水產育種學等研究領域。


斑馬魚基因敲除技術服務合同-活性sgRNA篩選

技術路線

1 分析目標基因的基因組結構

2 設計并體外合成sgRNA

3 體外合成Cas9 mRNA

4 鑒定所制備的sgRNA是否具有在斑馬魚胚胎內引導Cas9切割目標基因的活性


斑馬魚基因敲除技術服務合同-敲除突變體的建立(F1代)

技術路線

1 將有活性的sgRNA和Cas9 mRNA共同注射斑馬魚受精卵

2 將經注射的受精卵飼養至30-45日齡時,通過對尾鰭的基因組鑒定確認Founder體細胞攜帶目標基因突變的等位基因

3 獲得Founder的F1代

4 至30-45日齡時,通過剪尾鰭的方法進行基因型鑒定,篩選F1個體,獲得基因敲除突變體



基因敲入突變體制作(KI)

斑馬魚基因敲入技術服務合同—活性sgRNA篩選

技術服務流程

1 分析KI位置附近的DNA序列特征

2 設計單鏈供體(donor)

3 設計并體外合成sgRNA

4 體外合成Cas9 mRNA

5 鑒定所制備的sgRNA是否具有在斑馬魚胚胎內引導Cas9切割目標基因的活性

6 體外合成單鏈供體


斑馬魚基因敲入技術服務合同—基因敲入突變體建立(F1代)

技術服務流程

1將單鏈供體和有活性的sgRNA以及Cas9 mRNA共同注射到斑馬魚受精卵,建立基因敲入(KI)初建者(Founder)

2 提取10枚初建者的基因組DNA,通過擴增目標序列,鑒定確認Founder體細胞攜帶敲入的目標基因(KI)

3 獲得Founder的F1代

4 至60日齡時,通過剪尾鰭的方法進行基因型鑒定,篩選F1個體,獲得基因敲入突變體



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